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阿爾茨海默病突觸損傷的新機(jī)制,S-亞硝基化級(jí)聯(lián)反應(yīng)在神經(jīng)病理中可能具有重要意義

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在神經(jīng)系統(tǒng)中,一氧化氮(NO)過量可以產(chǎn)生亞硝化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致神經(jīng)退行性損傷【1】。在阿爾茨海默病(AD), β-淀粉樣肽(Aβ)的低聚化、過度神經(jīng)興奮、神經(jīng)炎癥等都會(huì)導(dǎo)致NO的產(chǎn)生,繼而發(fā)生S-亞硝基化【2】。
S-亞硝基化(S-nitrosylation,簡(jiǎn)稱SNO)是一種快速可逆和精確定向的翻譯后修飾,指NO陽離子(NO+)共價(jià)結(jié)合到半胱氨酸殘基巰基(S-)上。SNO是系統(tǒng)發(fā)育中細(xì)胞信號(hào)傳遞的基本機(jī)制【3】。 發(fā)動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白1(Drp1)是一種鳥苷三磷酸酶(GTPase),Drp1的S-亞硝基化會(huì)導(dǎo)致Drp1的過度激活,繼而導(dǎo)致線粒體的破碎和生物能量的不足,再進(jìn)而導(dǎo)致突觸丟失,而突觸數(shù)量減少與AD認(rèn)知能力下降密切相關(guān)【4-5】。因此這種S-亞硝基化反應(yīng)可能參與了該AD的發(fā)病機(jī)制。 已被S-亞硝基化的周期蛋白依賴性激酶5(Cdk5)通過去亞硝基化反應(yīng)將NO傳遞給Drp1,形成亞硝基化的Drp1【6】。然而,這種病理性的一系列連續(xù)反應(yīng)、及反應(yīng)參與者還有待確定。這一問題的正確回答,將有助于我們進(jìn)一步理解AD的發(fā)病機(jī)制,以及研發(fā)潛在的AD治療藥物。 美國(guó)斯克利普斯研究所(the Scripps Research Institute)的Stuart A. Lipton教授實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期從事于通過研究分子信號(hào)通路來阻止突觸損傷,以及正常衰老和各種神經(jīng)退行性疾病中的神經(jīng)元損傷。在于2020年12月3日以Noncanonical transnitrosylation network contributes to synapse loss in Alzheimer’s disease為題發(fā)表在Science上的新研究文章中,該實(shí)驗(yàn)室通過研究AD的體外和體內(nèi)模型、以及人類AD死后大腦組織揭示了具有不同生化途徑的不同催化活性的酶可以形成一種S-亞硝基化級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致AD突觸損失:NO基團(tuán)從去泛素化酶Uch-L1轉(zhuǎn)移到Cdk5,然后再轉(zhuǎn)移到Drp1。此研究提示一系列異常的亞硝基化途徑和去亞硝基化途徑在神經(jīng)退行性疾病的病理生理中可能伴有重要角色。

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Uch-L1,全稱泛素羧基末端水解酶L1,是一種去泛素化酶,水解泛素羧基末端加合成分,產(chǎn)生泛素單體【7】。為了方便,UCH-L1的S-亞硝基化,或S-亞硝基化的Uch-L1,統(tǒng)簡(jiǎn)稱為SNO-Uch-L1。生物素轉(zhuǎn)換方法(biotin-switch assay)是一種可以用來直接檢測(cè)細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)巰基亞硝基化(S-Nitrosylation)的生物素標(biāo)記方法【5,8】。首先作者通過生物素轉(zhuǎn)換方法在SH-SY5Y和HEK細(xì)胞模型證實(shí)了SNO-Uch-L1的存在,在AD小鼠中,SNO-Uch-L1的水平明顯上升。質(zhì)譜結(jié)果顯示Uch-L1的第152位點(diǎn)半胱氨酸的點(diǎn)突變(簡(jiǎn)稱C152S)則會(huì)顯著減弱這種S-亞硝基化。而且在Tg2576和hAPP-J20兩種AD小鼠、以及AD人腦組織中,SNO-Uch-L1導(dǎo)致Uch-L1酶活性降低,而過表達(dá)Uch-L1則會(huì)改善突觸功能和記憶性能。這些結(jié)果提示了Uch-L1活性在AD發(fā)病機(jī)制中的重要性。

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圖1 Aβ低聚物誘導(dǎo)SNO-Uch-L1的形成,進(jìn)而引起突觸的缺失
(T. Nakamura et al., Science 2020; aaw0843)

緊接著,作者注意到,在大鼠原代皮層神經(jīng)元中,過表達(dá)Aβ1-42低聚物會(huì)有SNO-Uch-L1的形成和突觸的丟失(圖1A-C)。那么,問題來了,突觸的丟失是由Aβ1-42低聚物所引起,還是由SNO-Uch-L1所引起,亦或是由兩者共同所致?在過表達(dá)Aβ低聚物的AD小鼠的齒狀回中注射Uch-L1,免疫組化結(jié)果證實(shí)SNO-Uch-L1會(huì)導(dǎo)致突觸的殘缺(圖1D-E)。這也暗示了人類AD中突觸丟失與認(rèn)知能力下降有密切的神經(jīng)病理學(xué)關(guān)系。

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圖2  NO基團(tuán)的連續(xù)轉(zhuǎn)移反應(yīng): 從Uch-L1轉(zhuǎn)移到Cdk5(SNOC為亞硝基半胱氨酸,提供NO基團(tuán))

(T. Nakamura et al., Science 2020; aaw0843)

那么,在Uch-L1、Cdk5和Drp1三者之間,NO的轉(zhuǎn)移有什么順序關(guān)系?或從誰到誰再到誰(圖2A)?之前有研究顯示NO可以從SNO-Cdk5轉(zhuǎn)移到Drp1,但是Cdk5上游的NO轉(zhuǎn)移機(jī)制,特別是由Aβ介導(dǎo)的SNO機(jī)制,我們并不清楚。通過免疫印跡、生物素轉(zhuǎn)變方法、SNO蛋白形成相對(duì)速率比較等一系列實(shí)驗(yàn),作者觀察到:在HEK細(xì)胞模型細(xì)胞模型內(nèi)敲低Uch-L1則會(huì)明顯觀察到Cdk5和Drp1、以及SNO-Cdk5和SNO-Drp1的先(10分鐘)后(25分鐘)下降(圖2-3);而在神經(jīng)元細(xì)胞模型SH-SY5Y中,相比較野生型Uch-L1,表達(dá)突變體Uch-L1,即C152S(前文結(jié)果可知其可顯著抑制Uch-L1的SNO)后,SNO-Cdk5和SNO-Drp1明顯較少(圖3A-E)。這些結(jié)果說明了NO轉(zhuǎn)移順序或SNO先后順序,即從Uch-L1到Cdk5再到Drp1。

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圖3 NO基團(tuán)的連續(xù)轉(zhuǎn)移反應(yīng): 從Uch-L1到Cdk5再到Drp1

(T. Nakamura et al., Science 2020; aaw0843)

能斯特方程(Nernst equation)是指用以定量描述某種離子在兩種不同體系間形成的擴(kuò)散電位的方程表達(dá)式【6,9】。在電化學(xué)中,能斯特方程用來計(jì)算電極上相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)電勢(shì)而言的指定氧化還原對(duì)的平衡電壓【6,9】。簡(jiǎn)言之,能斯特方程能夠表征離子濃度改變時(shí)電極電勢(shì)的變化。因此作者設(shè)計(jì)了一種能斯特方程,定量分析了S-亞硝基化反應(yīng)(SNO)的熱力學(xué)特征。結(jié)果也再一次肯定了上述關(guān)于NO基團(tuán)連續(xù)轉(zhuǎn)移的結(jié)論。 這些研究結(jié)果與人類AD的神經(jīng)病理生理學(xué)的相關(guān)性如何?因此,文章,研究人員應(yīng)用AD患者死后腦組織進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn):在AD疾病晚期SNO-UchL1的量顯著增加,而對(duì)照組SNO-Uch-L1的量極低(圖4A-B),這與Uch-L1的S-亞硝基化反應(yīng)只有在疾病狀態(tài)下的出現(xiàn)異常的先前觀點(diǎn)是一致的;而且SNO-Uch-L1與總UchL1的比值明顯增加,突觸缺失也更為嚴(yán)重(圖4A-B),這表明了在人AD腦內(nèi)中SNO-Uch-L1的異常增加,具有(或表現(xiàn)出)突觸病理生理意義(或特征),可能會(huì)加重AD。此外AD小鼠明顯中也有這些類似現(xiàn)象(圖4B)。

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圖4 AD患者大腦和小鼠中Uch-L1的SNO及比較,以及S-亞硝基化(NO轉(zhuǎn)移)模型

(T. Nakamura et al., Science 2020; aaw0843)


結(jié)論與討論、觀點(diǎn)與展望

總的來說,首先,這項(xiàng)研究表明,盡管Aβ具有神經(jīng)毒性,然而去泛素化酶Uch-L1的S-亞硝基化也具有神經(jīng)毒性,表現(xiàn)為突觸損傷,而Uch-L1突變體(C152S)則具有神經(jīng)保護(hù)作用。

其次,作者證實(shí)了NO的連續(xù)轉(zhuǎn)移反應(yīng):首先Aβ誘導(dǎo)產(chǎn)生NO,并與Uch-L1發(fā)生S-亞硝基化反應(yīng),形成SNO-Uch-L1;然后SNO-Cdk5發(fā)生S-去亞硝基化反應(yīng),產(chǎn)生新NO基團(tuán),并轉(zhuǎn)移到Cdk5上,形成SNO-Cdk5;同理,NO基團(tuán)從SNO-Cdk5轉(zhuǎn)移到Drp1,形成SNO-Drp1(圖4C)。這一級(jí)聯(lián)反應(yīng)可能影響AD的進(jìn)展。 研究也提示我們,揭示泛素水解酶、激酶和GTPase等酶在AD等疾病條件下的亞硝基化反應(yīng)機(jī)制可能是理解這些疾病病理過程的一類新思維,靶向這些酶的亞硝基化活性或去亞硝基化活可能是AD的治療靶點(diǎn)。 ,仔細(xì)看來,這篇文章的證據(jù)并不那么強(qiáng)有力,且還有很多未解之謎,但是研究者所提出的“非經(jīng)典亞硝基化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)”、“去亞硝基化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)”,或許為我們將來理解神經(jīng)退行性疾病(包括AD等)的復(fù)雜病理過程開辟了新思維、新方向。這種不同酶之間的亞硝基化級(jí)聯(lián)反應(yīng),與經(jīng)典的AD病理假設(shè)(Aβ,tau)、或其他非經(jīng)典AD病理假設(shè)之間的邏輯關(guān)系如何?答案未知。


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